RNA具有重要的生物学功能，很多非编码RNA可以折叠成复杂的三维结构以行使或参与重要的生命过程，如催化、转录和翻译调控等。但由于RNA三维结构信息的匮乏，导致目前对RNA三维结构与功能间关系的认知仍相对有限。冷冻电镜现已成为生物大分子结构解析不可或缺的技术，然而由于RNA结构本身较强的不均一性，因此纯RNA冷冻电镜高分辨结构的获得依然是很大的挑战。此前，冷冻电镜数据库中仅有不到10个分辨率优于5 Å的纯RNA结构，最高分辨率是3.7 Å。

四膜虫I类自剪接内含子（Tetrahymena group I self-splicing intron）是由美国科学家Tom Cech发现的首个在没有蛋白参与情况下具备酶催化活性的RNA，随后被命名为核酶（ribozyme），Tom Cech也因为这个发现获得了1989年的诺贝尔化学奖。四膜虫核酶的核心区域P3-P9具有非常紧凑的三维结构来形成酶催化位点，它也成为了研究RNA三维结构与催化功能关系的重要模型。

图1. 四膜虫核酶holo状态结合底物后进行催化反应。5’ 外显子（黄色）和3’ 外显子（橙色）在核酶的作用下连接形成外显子并最终离开四膜虫核酶。

8月11日，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室苏昭铭团队，联合美国斯坦福大学Wah Chiu和Rhiju Das团队，共同在Nature杂志上在线发表了最新研究成果“Cryo-EM Structures of Full-Length Tetrahymena Ribozyme at 3.1 Å Resolution”。该研究采用单颗粒冷冻电镜技术首次解析了全长四膜虫核酶在无底物结合状态（apo）和底物结合状态（holo）的高分辨结构（图1）。

“虽然Tom Cech之前解析了P3-P9区域3.8 Å的晶体结构，但包含周边区域的完整全长结构仍旧未知，这极大限制了人们了解四膜虫核酶周边区域如何远程调控核酶活性的结构机制。此外，3.8 Å的分辨率也不足以鉴别出很多参与催化反应的关键金属离子。”本研究第一和共同通讯作者苏昭铭研究员说道，“因此，解析四膜虫核酶的完整结构对于研究其结构功能关系尤为重要，同时对运用冷冻电镜研究其他RNA的结构与功能都具有重要参考意义。”

本研究通过解析四膜虫核酶的高分辨冷冻电镜结构，对不同结构域间的互作关系进行了深度解析，具体发现如下：

（1）首先揭示了apo状态下L-21 ScaI核酶的3.1 Å全长冷冻电镜结构，这也是目前分辨率最高的纯RNA冷冻电镜结构。该结构首次解析了外围区域结构并揭示了其与核心区域P3-P9间几个重要的长程相互作用。外围区域P2、P2.1、P9.1、P9.2通过形成两个假结结构（Pseudoknot）P13和P14，以及P14中的U43-A171-A172和P2-P2.1连接处的A31-U56-A95两个碱基三链体（Base triple），将P3-P9包围起来。

（2）发现了两种“始料未及”的长程相互作用。第一，P4螺旋中的核苷酸A210与P2中的A46之间形成氢键，并与P14中的G169形成一个碱基堆叠（stacking），这样的互作方式使三者之间形成一个“P2-P4-P14桥”的结构。之前的研究发现A210会降低四膜虫核酶的结构稳定性，但对全长核酶的活性却至关重要，这一长程相互作用为该结果做出了合理的解释。第二，P9.1中富含嘌呤的内环（bulge）G358、A359、G360可以与催化核心P7间形成“P7多嘌呤长程相互作用”（P7 purine-rich interaction）以稳定酶活位点的结构。以上两种结构发现展示了全新的外围区域与核心区域间互作的方式，说明了外围区域如何对酶活位点造成影响。

（3）通过比较核酶结合5’ 和3’ 外显子底物的holo状态与apo状态的结构，揭示了通过互补配对结合底物的内部引导序列（Interna guide sequence，IGS）的构象重排，以及酶活位点的构象变化。与底物结合后，IGS区向催化核心的方向发生了约60°的构象旋转，同时酶活位点中的碱基和金属离子也发生了一定程度的位移，虽然活性位点的大致结构在apo状态下就已基本形成。

（4）在holo状态的核酶中共鉴定出31个金属离子（M1~M31）。有些金属离子直接调控核酶的催化活性，其中包括先前通过生化功能实验鉴定出直接参与酶活反应的MA（M26）和MC（M27）、远程调控酶活的ME（M28）以及新发现的稳定酶活位点的M2。由于金属离子，尤其是镁离子，对RNA的正确折叠以及功能活性都起到了至关重要的作用，所以该研究也揭示了运用冷冻电镜研究RNA结构和功能的优势。

综上所述，该研究利用单颗粒冷冻电镜技术揭示了四膜虫核酶的全长高分辨三维结构，阐明了在底物结合和催化过程中IGS、金属离子、磷酸基团与碱基的构象变化，为长达40年来对四膜虫核酶剪接反应的研究提供了结构和机制上的支持，同时也为后续进行高分辨RNA冷冻电镜结构的研究提供了范式。

四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室、华西医院老年科与国家老年疾病临床医学研究中心为本研究的第一完成单位和通讯单位。苏昭铭研究员为本研究第一和共同通讯作者，中国科技大学张凯铭研究员和斯坦福大学Kalli Kappel博士为共同一作。四川大学华西生物国重室冷冻电镜中心工程师罗炳男参与了数据处理分析工作。同时，本研究得到了魏于全院士的大力支持。本研究由四川大学海外引进人才启动经费和国家自然科学基金等项目资助完成。

四川大学华西生物国重室冷冻电镜中心拥有300和200千伏前沿冷冻电镜各一台，同时配备了光电联用（CLEM）系统，可以进行高分辨单颗粒重构、断层成像（Cryo-ET）、微晶衍射（MicroED）等数据收集，现长期招聘具有一定电镜操作经验的工作人员；苏昭铭课题组的研究兴趣是运用冷冻电镜揭示病原RNA和RNA蛋白复合物的结构和功能，并基于RNA结构设计和筛选RNA靶向小分子化合物，作为潜在的分子探针和候选药物。